Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
МЕТОД КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ВЫБОР ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
Испытание выполняют с использованием достаточного количества как твердых, так и жидких питательных сред для того, чтобы в избранных условиях инкубации был обеспечен рост небольшого количества микоплазм, которые могут присутствовать в испытуемом продукте. Жидкие среды должны содержать феноловый красный. Для ряда сред показано наличие удовлетворительных питательных свойств, по крайней мере, для нижеперечисленных организмов. Для каждой новой партии среды должны быть подтверждены питательные свойства в отношении соответствующих организмов из списка.
Acholeplasma laidlawii (вакцины для медицинского и ветеринарного применения, в процессе производства которых используются антибиотики)
Mycoplasma gallisepticum (в случаях, когда для производства вакцин используются материалы, имеющие птичье происхождение или для вакцин, предназначенных для применения в птицеводстве)
Mycoplasma hyorhinis (ветеринарные вакцины, кроме птичьих)
Mycoplasma orale (вакцины для медицинского и ветеринарного применения)
Mycoplasma pneumoniae (вакцины для медицинского применения) или другие подходящие виды, связанные с ферментацией D-глюкозы
Mycoplasma synoviae (в случаях, когда для производства вакцин используются материалы, имеющие птичье происхождение или для вакцин, предназначенных для применения в птицеводстве).
Тест-штаммы представляют собой изоляты, подвергнутые не более, чем 15 пересевам, и хранящиеся в замороженном или лиофилизированном состоянии. После клонирования принадлежность штамма к требуемому виду определяется подходящим методом путем сравнения с типовыми культурами, например:
A. laidlawii M. gallisepticum
M. hyorhinis M. orale
M. pneumoniae M. synoviae
NCTC 10116 NCTC 10115 NCTC 10130 NCTC 10112 NCTC 10119 NCTC 10124
CIP 75.27 CIP 104967 CIP 104968 CIP 104969 CIP 103766 CIP 104970
ATCC 23206 ATCC 19610 ATCC 17981 ATCC 23714 ATCC 15531 ATCC 25204
УСЛОВИЯ ИНКУБАЦИИ
Инокулированную среду делят на две равные части, одну из которых инкубируют в аэробных условиях, а другую - в микроаэрофильных условиях; в случае твердых сред поддерживают атмосферную влажность, достаточную для предотвращения высыхания поверхности. В случае аэробных условий при инкубации твердых сред в атмосфере должно присутствовать от 5 до 10% диоксида углерода. Инкубацию в микроаэрофильных условиях проводят в атмосфере азота, в которой, в случае твердых сред, содержится от 5 до 10% диоксида углерода.
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА
Питательные свойства испытывают для каждой новой партии среды. Выбранные среды засевают соответствующими тест-организмами. На чашку диаметром 60 мм, содержащую 9 мл твердой среды, наносят не менее 100 колониеобразующих единиц, а в контейнер вместимостью 100 мл, содержащий соответствующую жидкую среду, вносят не менее 40 колониеобразующих единиц; для каждого вида организмов используют отдельные чашки и контейнеры. Среды инкубируют в условиях, в которых проводится основное испытание (аэробных, микроаэ-рофильных или тех и других, в зависимости от потребностей тест-организма). Среда выдерживает испытание на питательные свойства, если наблюдается адекватный рост тест-организмов, сопровождаемый соответствующим изменением окраски жидкой среды.
ИНГИБИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА
Проводят испытание на питательные свойства в присутствии испытуемого продукта. Если рост тест-организмов заметно менее выражен, чем в отсутствии испытуемого продукта, то последний содержит ингибирующие вещества, требующие нейтрализации (или исключения их влияния другим способом, например, разбавлением) перед проведением испытания на микоплазмы. Эффективность нейтрализации или иного процесса проверяется путем повторения испытания на ингибирующие вещества после нейтрализации.
ИСПЫТАНИЕ АНАЛИЗИРУЕМОГО ПРОДУКТА НА МИКОПЛАЗМЫ
В случае твердых сред используют чашки диаметром 60 мм, содержащие 9 мл питательной среды. Каждая из используемых сред должна содержаться не менее, чем в двух чашках. На каждую чашку наносят по 0,2 мл испытуемого продукта; в каждую жидкую среду вносят испытуемый продукт в соотношении 10 мл на 100 мл среды. Инкубируют при температуре от 35 до 380С в аэробных и микроаэрофильных условиях в течение 21 дня. Одновременно инкубируют порции по 100 мл каждой среды без испытуемого продукта для контроля. Если при добавлении испытуемого продукта происходит существенное изменение показателя рН, исходное значение восстанавливают добавлением раствора хлористоводородной кислоты или гидроксида натрия. В первый, второй и третий дни после инокуляции выполняют пересев по 0,2 мл каждой из жидких культур на чашки с твердыми средами (по две чашки для каждой из сред) и инкубируют при температуре от 35 до 380С в аэробных и микроаэрофильных условиях в течение не менее 21 дня. Процедуру повторяют на шестой, седьмой и восьмой, а также на тринадцатый и четырнадцатый дни испытания. Состояние жидких сред контролируют каждые два
или три дня и, в случае изменения окраски, выполняют пересев немедленно. Состояние твердых сред оценивают один раз в неделю.
